在完成小鼠原代腎動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的分離后，需重點(diǎn)關(guān)注細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性和功能維持。首先，將分離的細(xì)胞以適當(dāng)密度（建議1×10?/cm2）接種于預(yù)涂膠原蛋白的培養(yǎng)皿中，使用含20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。24小時(shí)后更換為含10% FBS的維持培養(yǎng)基，以降低增殖速率，促進(jìn)收縮表型表達(dá)。
關(guān)鍵操作提示：
1. 換液頻率：每48小時(shí)換液一次，避免頻繁擾動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞脫落。若觀察到細(xì)胞碎片增多，可先用PBS輕柔沖洗后再補(bǔ)液。
2. 傳代控制：細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)需傳代，使用0.25%胰酶-EDTA消化30秒后立即用含血清培養(yǎng)基終止。原代細(xì)胞建議傳代不超過3次，以免表型丟失。
3. 功能驗(yàn)證：可通過α-SMA免疫熒光染色（陽性率應(yīng)＞90%）及血管緊張素Ⅱ刺激實(shí)驗(yàn)（鈣離子熒光探針檢測(cè)）確認(rèn)細(xì)胞收縮特性。

常見問題應(yīng)對(duì)：
- 細(xì)胞貼壁不良：檢查膠原包被時(shí)間（需≥2小時(shí)）或嘗試添加纖連蛋白（10μg/mL）。
- 自發(fā)分化：若出現(xiàn)長(zhǎng)梭形形態(tài)改變，可添加5ng/mL TGF-β1維持表型。

    最后，建議凍存早期代次細(xì)胞（使用含10% DMSO的凍存液，程序降溫后液氮保存），為后續(xù)實(shí)驗(yàn)保留一致性樣本。通過規(guī)范操作和定期檢測(cè)，可確保該模型在高血壓或血管重塑研究中的可靠性。